纳米酶与天然酶相比，具有稳定性高、易修饰、可大规模生产、对复杂微环境的耐受性强等优点，近年来，具有不同形貌和类酶活性的纳米酶已被接连报道并广泛应用于化学传感、药物分析和生物诊疗等领域。然而以往报道的纳米酶大多需要复杂的化学合成和纯化，催化活性较高的单原子纳米酶甚至需要高温煅烧，由此带来较高的成本和繁琐的制备步骤。此外，基于纳米酶的生化传感体系大多只能呈现单信号的输出，容易对检测结果产生假阳性或假阴性的干扰。因此，探索简单、易制备，并具有较高类酶活性的新型纳米酶用于多信号生物传感具有重要意义。
图1基于“即混即用”型G-四链体/铜（II）金属纳米酶的比率荧光平台及其生物传感和生物计算应用。
针对以上问题，中国海洋大学医药学院范道庆副教授课题组设计开发了一种低成本、“即混即用”型的G-四链体/铜(II)金属纳米酶，图 1。利用EPR、CD、活性氧消除实验等多种方式，证明了该G-四链体/铜(II)金属纳米酶优异的类过氧化物酶活性，图2。基于金属纳米酶对两个具有相反响应的荧光底物（Sc和AU）的催化氧化，首次将其应用于比率荧光传感平台的构建，实现了同一体系中半胱氨酸（Cys）和抗癌药物-博来霉素（BLM）的高灵敏和选择性检测。值得一提的是，该体系在不需要任何掩蔽剂的存在下，就能够对Cys和His进行有效的区分。
图2. G4/Cu金属纳米酶类POD性质的验证 (A) 基于TMB-H2O2比色体系验证类POD活性的示意图；(B) TMB-H2O2的紫外-可见吸收光谱(黑色曲线)、Cu2+存在下(红色曲线)和G4/Cu金属纳米酶存在下TMB-H2O2 的吸收光谱(蓝色曲线) (插图：相应的颜色变化) (C) G4/Cu金属纳米酶在探索ROS种类时的EPR谱图；(D) TMB+H2O2+G4/Cu金属纳米酶体系在加入不同浓度PBQ后的紫外-可见吸收柱状图。
面向当前灵敏生物分析和智能诊断的需求，多功能纳米酶体系不仅可以进行靶标检测，还能执行生物运算功能。在上述比率荧光传感平台的基础上，作者将G-四链体/铜(II)金属纳米酶与“相反逻辑”运算进行合理结合，设计了一系列DNA相反逻辑对和多元化输入的多层级级联回路，满足了复杂生物运算网络的需求。该工作不仅通过一种低成本、可靠和“即混即用”的策略解决了当前纳米酶基生物传感器所面临的一些瓶颈问题，也为核酸生物计算与纳米酶催化两个领域的无缝集成提供了典型的范例。相关成果以“A cost-effective, “mix & act” G-quadruplex/Cu (II) metal-nanozyme-based ratiometric fluorescent platform for highly sensitive and selective cysteine/bleomycin detection and multilevel contrary logic computing”为题，近期发表在国际生物传感器权威期刊Biosensors and Bioelectronics (中科院1区TOP，IF=12.6)上，文章链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2023.115801，中国海洋大学医药学院硕士研究生王珺和博士研究生韩佳雯为论文的共同第一作者，中国海洋大学医药学院范道庆副教授和中科院长春应化所的董绍俊院士为共同通讯作者。
基于DNA的逻辑纳米器件由于其低成本、易合成、高可编程性和其他固有的优点而被确定为生物运算中最优异的候选者之一，除了分子运算，DNA逻辑纳米机器在智能生物应用中也是强有力的工具。虽然取得了突出的成就，但是之前的工作仍然存在一定问题。第一，需要长时间合成和纯化步骤的纳米材料，昂贵的DNA工具酶以及需要特定序列设计的链置换反应，都导致了冗长的操作时间、高成本和较低的运算效率。第二，以前的体系只实现了功能相反的逻辑门，计算的灵活性受到了一定的限制。第三，基于相反逻辑对的生物传感应用鲜有报道。因此，迫切需要构建一个快速、低成本的多功能伴生逻辑运算平台并探索其智能生物传感应用。
针对以上提出的问题，该课题组通过将具有快速响应特点的DNA铜簇(CuNC)和核酸嵌插染料(SG I)集成为统一的双输出信号源(图3)，构建了不同的伴生相反逻辑对、伴生非相反逻辑对以及级联回路，以上器件都可以在10分钟内成功运行。该体系不需要标记探针和纳米淬灭剂的参与，因此只需要以往工作1/12的运行时间和1/4的成本。此外，所有逻辑器件的输出都可在便携式紫外灯的辅助下被轻易地可视化识别，同时共享统一阈值，推动了器件的潜在实际应用。
图3. 多功能伴生DNA逻辑纳米器件的总体运行原则及其智能生物传感应用。
poly-A尾巴可以调节mRNA的表达和稳定性，对翻译的起始至关重要。poly-A聚合酶能够催化RNA 3’端poly-A的合成，与疾病的发生发展密切相关。此外，poly-A聚合酶和miRNA在乳腺癌、胰腺癌、结肠癌和许多其他癌细胞中过度表达,被认为是典型的肿瘤标志物。在以上工作的基础上，该课题组基于相反逻辑的智能性和数字化特点实现了肿瘤标志物poly-A DNA 和poly-A聚合酶的智能逻辑分析检测，图4，双靶标刺激相应的相反逻辑器件的运行可以对检测结果进行正反交叉验证，提高了癌症早期诊断的可靠性和精准性。相关成果以“Toward Minute-Level DNA Computing: An Ultrafast, Cost-Effective, and Universal System for Lighting Up Various Concurrent DNA Logic Nanodevices (CDLNs) and Concatenated Circuits”为题，发表在国际分析传感领域权威期刊-美国分析化学Analytical Chemistry (中科院1区TOP，IF=7.4)上，文章链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c03793，中国海洋大学医药学院博士研究生韩佳雯为论文的第一作者，中国海洋大学医药学院范道庆副教授和中科院长春应化所的董绍俊院士为共同通讯作者。
图4.(A) poly-A聚合酶检测示意图；(B) AND^NAND相反逻辑对的等效逻辑电路图；(C)相对应的真值表；(D)在不同浓度poly-A聚合酶存在下的SG I荧光谱图；(E) 在不同浓度poly-A聚合酶存在下的CuNC荧光谱图；(F)FI525/FI625与poly-A聚合酶浓度之间的线性关系。
医药学院范道庆副教授指导的“智能分子逻辑与药物分析”课题组自2021年9月成立以来，在DNA纳米技术、分子逻辑器件构筑、抗癌药物分析检测、纳米酶生物传感应用等领域开展了一系列研究工作。值得一提的是，他们于2022年对近十年来基于抗癌药物甲氧檗因COR的生物传感器的研究进展进行了系统性的梳理、总结和展望，图5。相关成果以“Recent Advancements in Coralyne (COR)-based Biosensors: Basic Principles, Various Strategies and Future Perspectives”为题，于2022年5月发表在国际生物传感器权威期刊Biosensors and Bioelectronics (中科院1区TOP，IF=12.6)上，文章链接: https://doi.org/10.1016/j.bios.2022.114343，中国海洋大学医药学院博士研究生韩佳雯为论文第一作者，中国海洋大学医药学院范道庆副教授为通讯作者。此外，在以上综述的基础上，应分析传感领域期刊Biosensors邀请，基于G-四链体和Py标记荧光探针的巧妙联用，构建了第一个具有比率荧光响应的传感器用于COR的高灵敏和选择性检测，2023年以“Integration of G-Quadruplex and Pyrene as a Simple and Efficient Ratiometric Fluorescent Platform That Programmed by Contrary Logic Pair for Highly Sensitive and Selective Coralyne (COR) Detection”为题，发表在期刊Biosensors (IF=5.4, 专刊邀稿)上，中国海洋大学医药学院博士研究生韩佳雯为论文的第一作者，中国海洋大学医药学院范道庆副教授为通讯作者。
图5. 基于抗癌药物甲氧檗因（COR）的传感器的系统性分类总结-示意图。
以上工作的第一完成单位均为中国海洋大学医药学院，研究的开展得到了中国海洋大学“青年英才工程”启动经费、崂山国家实验室创新人才经费、山东省自然科学青年基金、山东省优秀青年科学基金、国家自然科学青年基金、中国海洋大学“优秀青年科技人才培育计划”等项目经费的大力支持。
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