江涛教授团队采用氨基酸侧链保守修饰策略进一步阐明了α-芋螺毒素Vc1.1与人α9α10烟碱乙酰胆碱受体作用的构效关系

    烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）是人们最早发现的由5个亚基组成的跨膜五聚体，是介导突触间快速信号传递的配体门控离子通道蛋白，在中枢和外周神经系统及肌肉中广泛分布。其涉及一系列神经系统疾病和病症，包括帕金森病，阿尔茨海默病，精神分裂症，神经性疼痛，记忆丧失和压力调节，因此是重要的药物靶点。α9α10 nAChR为近年来新发现的乙酰胆碱受体亚型之一，主要分布在哺乳动物的耳蜗，与听觉系统的形成有关。后经过多项研究证明，α9α10 nAChR亚型是治疗慢性疼痛的靶标，对外伤和化疗引起的疼痛具有明显作用。Vc1.1是一种从Conus victoriae毒液中提取的α-芋螺毒素，能够特异性地有效抑制α9α10 nAChR，具有强大的镇痛活性，有成为治疗神经性疼痛的新药物潜力。

    中国海洋大学医药学院江涛教授团队与澳大利亚卧龙岗大学的David Adams课题组合作，通过分子动力学模拟、定点突变以及结合电生理学实验的方法，从分子水平上进一步阐明并验证了α-芋螺毒素Vc1.1与α9α10 nAChR的相互作用的构效关系，为Vc1.1类似物作为分子探针或者镇痛药物的开发奠定了基础。

    迄今为止，α-芋螺毒素Vc1.1结合α9α10 nAChR的晶体尚未被解析，模型构建以及定点突变研究已经成为研究其构效关系的有效手段。研究者针对之前所建立的模型（Yu et al. 2018 J Med Chem）分析发现Vc1.1中的S4位于α9亚基的D166和D169附近，并与D166形成了氢键，于是研究者在4位引入了带正电荷的氨基酸，使其通过与受体形成静电相互作用从而提高其活性，并且对其侧链的长短对活性的影响也进行了探究。此外，研究者在分子动力学模拟中发现Vc1.1中Y10的羟基与α9中的N107和D119形成了两个氢键，为了研究羟基对Vc1.1结合活性的贡献，研究者在10位引入了苯丙氨酸。同时，也将Vc1.1中Y10的羟基用F或Cl原子替代，以探索由于去除羟基而与附近的残基形成氢键或者卤键的可能性。最后，研究者从所建立的模型中还发现了Vc1.1中的D11与α9亚基中的N154和R81的侧链形成了氢键和盐桥相互作用，于是在11位引入了谷氨酸和γ-羧基谷氨酸通过取代D11来探究侧链长度和电荷对其活性的影响。

    通过电生理双电极电压钳技术对所合成的Vc1.1类似物进行了活性测试，同时为了从分子水平进一步阐释α-芋螺毒素Vc1.1与α9α10 nAChR的相互作用机制，对所有的Vc1.1类似物进行了模型构建与分子动力学模拟。通过电生理数据分析以及分子动力学模拟的结果表明，Vc1.1的S4与α9亚基的D166和D169形成了氢键，并且在该位置引入侧链长短合适且带正电荷的氨基酸可以提高其活性。同时证实了P6位于α9亚基的D119附近，引入的Hyp6接近D119且与其形成了氢键。此外，Y10侧链上的羟基与α9亚基的N107和D119形成的氢键对其活性起着至关重要的作用。而侧链长度和负电荷数对于Vc1.1的11位残基是必不可少的。最后，研究者根据第一代Vc1.1类似物的活性与分子动力学模拟的结果，设计了第二代突变体[S4Dab，N9A]Vc1.1和[S4Dab，N9W]Vc1.1，并对其进行了活性测试，其IC₅₀分别为52.5 ± 3.2 nM与38.7 ± 2.8 nM，与野生型Vc1.1相比活性提高约20倍。

   总之，本研究提出了一种采用氨基酸侧链的保守修饰来精确验证芋螺毒素结合模式的方法，并获得了两个活性提高20倍的变异体，为镇痛药物的研究以及从分子层面解释芋螺毒素跟受体相互作用关系提供了理论和技术的指导。